单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程技术,基因工程技术,Jackson,Symons,and Berg(1972),generated first,recombinant DNA molecules,Cohen and Boyer(1973),produced first plasmid vector capable of,being replicated within a bacterial host,The Nobel Prize in Chemistry 1980,Jackson,Symons,and Berg(197,定义：,基因工程（,gene engineering,）,重组,DNA,技术,（,recombinant DNA technique,）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组,DNA,分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为,“克隆”,）和,表达,，这种有目的的应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程，总称为基因工程。
定义：基因工程（gene engineering）,应用：,克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多肽产品转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等,应用：克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构基因工程基本,步骤,：,分、切 目的基因,+,载体分子,转 导入到合适的受体细胞（转化）,接 构成重组,DNA,分子,筛 筛选含有重组分子的克隆,鉴 鉴定重组分子片段,基因工程基本步骤：分、切 目的基因,基因工程流程示意图,基因工程流程示意图,构建重组分子（连接）,原料,：,目的基因：,研究对象,载体：,目的基因的运载工具,工具酶：,连接酶、限制性内切酶,构建重组分子（连接）原料：目的基因：研究对象,目的基因片段,来源,：,基因组,DNA,（非编码序列）,PCR,方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆构建或从商品化的,cDNA,文库扩增）,通过,RT-PCR,方法得到目的基因,cDNA,人工合成基因片段（价钱昂贵）,目的基因片段来源：基因组DNA（非编码序列）,目的基因,来源选择,：,取决于解决什么问题？,基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表达调控的研究,基因组,DNA,PCR,目的基因来源选择：取决于解决什么问题？cDNART-PCR基,PCR,：,引入合适的酶切位点，一个,/,两个。
加保护碱基，,1-3,个加上想要的标签，如,Flag,Myc,His,HA,启始及终止密码子高保真聚合酶：,HF,，,Pfu,，,Probest,等PCR：引入合适的酶切位点，一个/两个高保真聚合酶：HF，,片断的回收与纯化,片断的回收与纯化,载体：,载体,(,Vector),是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达种类：,按来源分：质粒载体,(plasmid vector),、噬菌体载体,(phage vector),、,柯氏质粒载体,(cosmid vector),、病毒载体,(virus vector).,按作用分：克隆载体,(cloning vector),、表达载体,(expression vector),、穿梭载体,(shuttle vector),载体：载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目,克隆载体,(cloning vector),用于在受体细胞中进行目的,基因扩增,的载体一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的,DNA,重组构建（,pBR322,）表达载体,(expression vector),使,目的基因在宿主细胞中得以表达,的载体。
可将重组体,DNA,导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（,pcDNA3,）克隆载体(cloning vector),穿梭载体,(shuttIe vector),能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的,复制原点或酵母菌的自主复制序列（,ARS,），它即能在,原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达,主要用,于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移穿梭载体(shuttIe vector)能在两种不同的,质粒载体,具有,复制起始点,，这是质粒自我增殖的必要条件具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个,松弛型,的质粒具有某种,选择性标记,以区别转化和非转化细胞大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利Amp,r,；,Tet,r,）,具有若干限制性内切酶,单一,识别位点，便于外源基因插入是细菌染色体外能够自我复,制的双链环状,DNA,分子质粒载体具有复制起始点，这是质粒自我增殖的必要条件是细菌染,克隆载体,:,pBR322,特点：,分子量小，,4.3kb,，便于操作有两个抗性基因，便于转化子筛选。
有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，,7,种位于四环素选择标记上，,4,种位于,Amp,抗性基因上外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因,插入失活,，这种特性可用于区分重组和非重组分子松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制克隆载体:pBR322 特点：,基因工程技术分子生物学ppt课件,TA,克隆,A,A,TA 克隆AA,TOPO-TA,TOPO-TA,原核,His-tag:pQE,系列,(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX,系列,(Pharmacia),表达载体：,带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应原核 His-tag:pQE系列(Qiagen),pcDNA 3,系列,(Invitrogen),，,真核表达载体：,大多是穿梭载体pcDNA 3系列(Invitrogen)，真核表达载体：,pFLAG-CMV,系列,(Sigma),pFLAG-CMV系列(Sigma),DNA,分子的体外连接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接,DNA分子的体外连接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配对,两种情况：,（,a,）,目的基因和载体,用,同一种限制酶切割,后连接。
载体,易,自身环化,用,碱性磷酸酶,(,能除掉,DNA,两端的,5,磷酸基团）处,理载体，可防止载体自身环化b,）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶,切割后连接，可控制目的基因的插入方向,(,定向克隆,),两种情况：（a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接载体,碱性磷酸酶处理：,碱性磷酸酶处理：,平头末端：,（,1,）增加连接酶的量（连接酶对平末端,DNA,的,Km,约高于粘性末端,DNA100,倍）,（,2,）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内,切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体,连接如加上一个人工接头内含,GAATTC,序列，用,EcoRI,酶切，产生,EcoRI,粘性末端平头末端：（1）增加连接酶的量（连接酶对平末端DNA的Km,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco REco REco R,连接,策略,：,pCMV,连接策略：pCMV,连接浓度：,片段与载体连接机率自身环化,一般计算公式：,粘性末端：,载体片段含量（,ng,）,/,载体长度（,kb,）,1,DNA,片段含量（,ng,）,/DNA,片段长度（,kb,）,3-5,平末端,1,：,5 10,连接浓度：片段与载体连接机率自身环化,连接反应：,10ul,体系,H,2,O,Buffer,Vector,Insert,ligase,14,过夜,连接反应条件,连接酶的活性；,DNA,的纯度；载体与目的基因的比例；,PH,值,7.2-7.8,适宜；,14(,不高于,16),过夜,连接反应：10ul 体系H2O 14过夜连接反应条件,连接酶：两种,DNA,连接酶：,连接双链中两条,DNA,链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架缺口。
需要一条,DNA,链的,3-,末端具有游离的,OH,，另一条,DNA,链,5-,末端的磷酸基团,-P,，吸能反应，需,ATP,存在也可做,DNA,修复但不能连接两条单链,DNA,分子和环化的单链,DNA,分子而且只能连接粘性末端T4 DNA,连接酶：,是从感染,T4,噬菌体的,E,coli,中分离得到的一种连接酶粘性末端、平末端、平末端上加人工接头用途比,DNA,连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶连接酶：两种DNA连接酶：连接双链中两条DNA链之间形成磷酸,其他酶：末端修饰酶,末端脱氧核苷酸转移酶（,terminal deoxynucleotidyl transferase,）,简称末端转移酶在合适的反应系统中，这种酶使,DNA,片段平末端的,3-OH,加上同聚核苷酸，产生具有,poly,（,A,）、或,poly,（,T,）、或,poly,（,G,）、或,poly,（,C,）的粘性末端碱性磷酸酶,根据,DNA,重组的需要，为防止两,DNA,片段末端之间连接，经常采用碱性磷酸酶处理，使,DNA,末端的,5-P,成为,5-OH,目前采用的碱性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（,BAP,）和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（,CIP,）。
CIP,的比活性比,BAP,高出,10,倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活其他酶：末端修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal d,重组子导入受体细胞：,把重组,DNA,导入受体细胞进行扩增,.,根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞（原核，真核）及选择适宜的转化或转染的方法受体细胞的要求：必须具备使外源,DNA,进行复制的能力（提供复制所需的原料）而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定重组子导入受体细胞：把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所,重组子导入受体细胞：途径,转化：,质粒,DNA,或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌）的过程,转染：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动被导入细胞的过程感染：以病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上重组子导入受体细胞：途径转化：质粒DNA或以它为载体构建的重,转化,受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞,转化机理：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源,DNA,发生可遗传的改变转化效率：,只有很少比例的细胞有能力掺入质粒,DNA,转化时大约在,1000,个,DNA,分子中，只有一个,DNA,分子获得成功。
一般每微克完整的,pBR322DNA,产生,10,5-,10,7,转化细胞,转化受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞,感受态菌制备,感受态：,细菌细胞处于一个容易吸收外源,DNA,状态，这种状态的细菌称为感受态菌氯化钙法,：,氯化镁法：,电转法：,感受态菌制备感受态：细菌细胞处于一个容易吸收外源DNA状态，,氯化钙,法：,原理,快速生长的细菌用低渗低浓,(50 100mM),的氯化钙（,CaCl,2,),处理，使细胞肿胀成球形,加入质粒后，即于细胞表面形成抗,DNAase,的羟基,-,磷酸钙复合物,经,42,热休克后，复合物被细胞吸收非选择性培养基上生长数小时，球状细胞复原开始增殖,抗生素基因表达氯化钙法：原理快速生长的细菌用低渗低浓(50 100m,重。
